貼壁細胞傳代的方法和注意事項

　　細胞培養(yǎng)幾乎是所有細胞生物學實驗的基礎。其中，細胞傳代是將部分細胞分離出來，重新接種到新的培養(yǎng)皿中，使細胞重新獲得足夠的營養(yǎng)條件和生長空間的過程。對于貼壁生長的細胞，細胞密度長到80%-90%時，細胞狀態(tài)最好，此時可進行細胞傳代。下面讓我們一起來看看貼壁細胞傳代的方法和注意事項吧！
 

　　一、貼壁細胞傳代（以T25瓶為例）
 

　　1.顯微鏡下觀察細胞匯合度大于80%即可傳代；
 

　　2.將移液管、移液槍、T25培養(yǎng)瓶、1ml槍頭、PBS溶液等放入超凈工作臺，紫外燈滅菌30min后再通風30min；
 

　　3.培養(yǎng)基放置37℃水浴鍋預熱；
 

　　4.將胰酶和培養(yǎng)基用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
 

　　5.在培養(yǎng)箱內旋緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，拿出細胞，用75%酒精消毒后放入超凈工作臺；
 

　　6.吸棄上清液；
 

　　7.用5mlPBS液潤洗細胞，吸棄PBS；
 

　　8.培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，輕輕晃動使胰酶充分覆蓋細胞層，放入培養(yǎng)箱中孵育；
 

　　9.在顯微鏡下觀察細胞解離狀況，細胞明顯變圓、細胞間隙增大，輕輕晃動可呈現(xiàn)流沙狀即可終止；
 

　　10.加入4ml培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞層表面數(shù)次，使其分散成單個細胞；
 

　　11.收集細胞懸液到50ml離心管中，1000-1200r/min離心，3-5min去除胰酶；
 

　　12.離心管用75%酒精消毒后放入超凈工作臺，吸棄上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞；
 

　　13.將細胞懸液按推薦傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶，補充適量培養(yǎng)基，搖晃使細胞分布均勻，并做好標記；
 

　　14.在顯微鏡下觀察細胞密度及狀態(tài)，把細胞放回培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋以便進行氣體交換。
 

　　二、注意事項：
 

　　1.PBS潤洗細胞時，從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入PBS，避免沖刷到細胞層；
 

　　2.不同細胞的胰酶所需消化時間不一樣，消化時間根據(jù)細胞貼壁特性而定，可每30s觀察一次。
 

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