細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的操作步驟與注意事項(xiàng)

　　細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程。當(dāng)恢復(fù)到常溫狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常，生化反即刻恢復(fù)。細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程升溫要快，原則是慢凍快融，防止在解凍過(guò)程中水分進(jìn)入細(xì)胞，形成冰晶，影響細(xì)胞存活。下面讓我們一起來(lái)看看細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)的操作步驟與注意事項(xiàng)吧！
 

　　一、操作步驟
 

　　1.將10ml移液管、移液槍、1ml槍頭、50ml離心管、T25培養(yǎng)瓶、酒精燈、廢液缸等物品放入超凈工作臺(tái)，紫外燈照射30min后再通風(fēng)30min；
 

　　2.預(yù)熱培養(yǎng)基；
 

　　3.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
 

　　4.將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出；
 

　　5.放入一次性手套于37℃水浴鍋中快速晃動(dòng)使其融化；
 

　　6.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
 

　　7.吸取9ml培養(yǎng)基到50ml離心管中；
 

　　8.用1ml槍頭吸取解凍的細(xì)胞懸液于離心管中；
 

　　9.1000r/min,離心5min；
 

　　10.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
 

　　11.吸棄上清液；
 

　　12.吸取1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記；
 

　　13.在顯微鏡下觀察復(fù)蘇的細(xì)胞密度及狀態(tài)；
 

　　14.將細(xì)胞放回二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
 

　　二、注意事項(xiàng)
 

　　1.從液氮罐中取出細(xì)胞時(shí)，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)以免凍傷；
 

　　2.凍存細(xì)胞取出后，如不能立即放入水浴鍋中融化，需將其放在干冰上保存轉(zhuǎn)移；
 

　　3.細(xì)胞水浴解凍時(shí)間以1min內(nèi)為宜，做到慢凍速融；
 

　　4.已解凍的細(xì)胞避免長(zhǎng)時(shí)間常溫存放，需盡快離心去除DMSO；
 

　　5.剛復(fù)蘇的細(xì)胞貼壁尚不牢固，24h內(nèi)不要頻繁觀察和換液；
 

　　6.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，并將瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換(如使用透氣性瓶蓋，則無(wú)需旋松瓶蓋)。
 

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