CCK-8實(shí)驗(yàn)全攻略：原理、步驟與注意事項(xiàng)

　　在細(xì)胞生物學(xué)、藥物開發(fā)、腫瘤研究等領(lǐng)域，快速、準(zhǔn)確地評(píng)估細(xì)胞增殖與毒性是至關(guān)重要的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。其中，CCK-8試劑盒因其操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、安全性好等優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)配檢測(cè)方法。
 

　　一、CCK-8實(shí)驗(yàn)原理：高效的酶促反應(yīng)顯色
 

　　CCK-8.全稱為Cell Counting Kit-8.其核心原理是一種基于顯色反應(yīng)的生物化學(xué)檢測(cè)方法。
 

　　在活細(xì)胞內(nèi)部，始終存在一種名為線粒體脫氫酶的代謝酶。該酶具有持續(xù)的活性。CCK-8試劑中含有一種名為WST-8 的獨(dú)特水溶性四唑鹽化合物。
 

　　當(dāng)活細(xì)胞與CCK-8試劑共同孵育時(shí)，會(huì)發(fā)生以下連鎖反應(yīng)：
 

　　WST-8分子進(jìn)入細(xì)胞。
 

　　在活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶催化下，WST-8被還原，生成高度水溶性的橙色甲瓚產(chǎn)物。
 

　　該甲瓚染料會(huì)溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液中，且其生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
 

　　因此，通過(guò)使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量培養(yǎng)液的吸光度值，即可直接、準(zhǔn)確地反推出樣品中活細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。細(xì)胞增殖越快或毒性越小，吸光度值就越高。
 

 

　　二、CCK-8實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟(以96孔板為例)

 

　　實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
 

　　儀器： 酶標(biāo)儀、CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、移液器。
 

　　材料： 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、CCK-8試劑。
 

　　細(xì)胞： 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健康細(xì)胞。
 

　　DAY 1
 

　　1. 對(duì)前一天培養(yǎng)好的細(xì)胞消化、離心、計(jì)數(shù)。
 

　　2. 在96孔板上接種100μL 3k-7k/孔的細(xì)胞，在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
 

　　DAY 2
 

　　1. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞分布及密度均一的孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
 

　　2. 配制不同濃度梯度的樣本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)度。如6.12.24或48小時(shí)。
 

　　DAY 3/4
 

　　1. CCK8使用前在室溫下解凍并離心。
 

　　2. 用倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并用4X/10X取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞分布及密度均一的孔拍照記錄。
 

　　3. 在每孔中加入10μL的CCK-8溶液。
 

　　4. 在37℃、5% CO2、90%濕度條件下培養(yǎng)0.5-4小時(shí)。
 

　　5. 用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量吸光度。
 

　　6. 用Excel及Graphpad Prism處理并分析結(jié)果。
 

　　7. 結(jié)果示例圖：

 

　　三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與技巧

 

　　避免氣泡： 孔內(nèi)氣泡會(huì)嚴(yán)重干擾讀數(shù)，加樣和檢測(cè)前可短暫離心孔板以去除氣泡。
 

　　設(shè)置復(fù)孔： 建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，以確保數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
 

　　孵育時(shí)間優(yōu)化： 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致顏色過(guò)深，超出檢測(cè)線性范圍;過(guò)短則信號(hào)太弱。必須通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳時(shí)間。
 

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