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更新時間：2025-11-17
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這款試劑盒是一款性能優異、操作非常簡便的預混式反轉錄試劑，它將所有所需組分（除模板RNA和RNase Free水外）預先混合在一起，大大減少了操作步驟和污染風險。
Takara RR047A 操作步驟：
以下是標準的操作流程，非常簡潔。在進行操作前，請務必在冰上進行，并使用RNase-Free的槍頭和試管。
實驗前準備：
1. RNA模板： 確保RNA質量好，無降解，無基因組DNA污染。建議使用前用DNase I處理RNA樣本。
2. 試劑解凍： 將RR047A Master Mix置于冰上wanquan解凍，使用前輕輕渦旋混勻，避免產生氣泡。
第一步：配制反應體系
在一個無菌、無RNase的微量離心管中，按以下順序和用量加入各組分：
組分 | 體積 | 說明 |
5× PrimeScript RT Master Mix | 4 µL | 包含酶、引物、dNTPs、緩沖液等所有核心成分 |
Total RNA | 可變 (X µL) | 推薦使用量： |
RNase Free dH?O | 補足至 20 µL | 用于調整總體積 |
總體積： 20 µL
計算示例： 如果你要加入 500 ng 的 RNA（濃度為 100 ng/µL，則需要 5 µL），那么計算如下：
5× Master Mix： 4 µL
RNA： 5 µL
RNase Free dH?O： 20 - 4 - 5 = 11 µL
注意： 輕輕用移液器吹打混勻，短暫離心收集液滴至管底。
第二步：進行反轉錄反應
將配制好的反應管放入PCR儀或水浴鍋中，按以下程序運行：
1. 37°C for 15 分鐘 （反轉錄反應）
2. 85°C for 5 秒 （反轉錄酶失活反應）
3. 4°C 保持 （暫時保存）
程序解讀：
37°C， 15分鐘： 這是反轉錄酶合成cDNA的最佳溫度和時間。
85°C， 5秒： 這是一個快速的熱失活步驟，用于滅活反轉錄酶，防止其在后續的qPCR反應中干擾Taq酶的活性。這是RR047A的一個重要優點，無需復雜的純化步驟即可直接用于qPCR。
第三步：產物保存與使用
反應結束后，將得到的cDNA溶液置于冰上，可立即用于后續的PCR或qPCR實驗。
若需長期保存，請置于 -20°C 冰箱。避免反復凍融，建議分裝保存。
注意事項：
1. RNA質量： 這是實驗成功的首要條件。確保RNA的完整性（通過瓊脂糖凝膠電泳檢查），并且A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明純度良好。
2. 無基因組DNA污染： 如果后續進行qPCR并需要高精度定量，強烈建議在反轉錄前用gDNA Eraser（Takara的另一款產品）處理RNA樣本，以ce di去除基因組DNA。
3. 無RNase操作： 全程使用RNase-free的槍頭、離心管和試劑，佩戴手套，防止RNase污染導致RNA降解。
4. 精確加樣： 確保所有組分的加樣量準確，尤其是Master Mix和RNA模板。
5. 陰性對照： 建議設置一個無酶對照（No-RT Control），即用等量的水代替Master Mix。這個對照在后續qPCR中用于檢測是否有基因組DNA的殘留擴增。
總結
Takara RR047A（PrimeScript RT Master Mix） 的核心優勢在于其預混形式和快速熱失活特性。它將復雜的多組分混合步驟簡化為“一步加樣"，并通過短短5秒的85°C加熱即可滅活酶活，使得從RNA到cDNA再到qPCR的整個過程可以無縫、高效、高通量地進行，極大地提高了實驗的重復性和便捷性，特別適用于基因表達分析（qRT-PCR）研究。
Takara代理——天津益元利康生物科技有限公司
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