qPCR的核心原理

讓小編來詳細解析一下qPCR（實時熒光定量PCR）的原理。這是一項在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、生物技術(shù)等領(lǐng)域的核心技術(shù)。

 一、qPCR的核心原理：實時監(jiān)測與定量

簡單來說，qPCR是一種在PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）擴增過程中，通過熒光信號對DNA模板進行實時監(jiān)測和定量的技術(shù)。

它解決了傳統(tǒng)PCR只能進行終點檢測（擴增結(jié)束后通過電泳看條帶）而無法精確定量的問題。

二、兩種主流的信號產(chǎn)生機制：

 1. 非特異性檢測：DNA結(jié)合染料法（如SYBR Green）

- 原理：SYBR Green是一種能特異性地嵌入雙鏈DNA（dsDNA）小溝中的熒光染料。當(dāng)它與dsDNA結(jié)合后，熒光強度會顯著增強。

- 過程：在每輪PCR的延伸階段，新合成的雙鏈DNA會結(jié)合染料，并發(fā)出熒光。熒光強度與反應(yīng)體系中的雙鏈DNA總量成正比。

- 優(yōu)點：成本低，使用方便，無需設(shè)計探針，適用于任何PCR擴增。

- 缺點：特異性較低。染料會結(jié)合任何雙鏈DNA，包括非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體，從而產(chǎn)生假陽性信號。因此必須通過熔解曲線分析來驗證擴增產(chǎn)物的特異性。

 2. 特異性檢測：水解探針法（如TaqMan探針）

- 原理：該技術(shù)使用一個序列特異性的寡核苷酸探針。探針的5‘端帶有一個報告熒光基團，3’端帶有一個淬滅熒光基團。

- 過程：

    1.  當(dāng)探針完整時，由于報告基團和淬滅基團距離很近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，報告基團的熒光被淬滅。

    2.  PCR擴增時，當(dāng)引物退火，探針也會特異性地結(jié)合到模板上。

    3.  Taq酶在延伸過程中，利用其5‘→3’外切核酸酶活性將探針水解，使報告基團與淬滅基團分離。

    4.  報告基團隨即發(fā)出熒光。

- 優(yōu)點：特異性ji高。只有靶序列被擴增時才會產(chǎn)生熒光信號，有效避免了非特異性擴增的干擾。

- 缺點：成本較高，需要為每個靶基因精心設(shè)計并合成探針。

 三、如何定量？—— Ct值的概念

qPCR定量的關(guān)鍵在于 Ct值。

- 定義：Ct值 是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

- 意義：模板DNA的起始拷貝數(shù)越多，達到熒光閾值所需的擴增循環(huán)數(shù)就越少，即Ct值越小。反之，起始拷貝數(shù)越少，Ct值越大。

- 定量基礎(chǔ)：理論上，PCR每個循環(huán)產(chǎn)物量翻倍（指數(shù)增長期）。因此，兩個樣品之間的Ct值相差1，意味著起始模板量相差約2倍。

通過已知濃度的標準品繪制標準曲線，就可以根據(jù)未知樣品的Ct值精確計算出其起始模板量。定量方法主要有絕對定量和相對定量。

  總結(jié)

qPCR技術(shù)憑借其高靈敏度、高特異性、精確定量和操作便捷的特點，已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究和分子診斷的基石技術(shù)。從基礎(chǔ)科研的基因功能探索，到臨床的疾病診斷與監(jiān)控，再到食品安全檢測，其應(yīng)用無處不在。理解其原理是正確進行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。

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