貼壁細胞傳代操作步驟

一、細胞傳代

細胞傳代培養是指將細胞從一個培養瓶中移植到下一個培養瓶中，繼續培養和增殖的過程。傳代培養的目的是實現細胞擴增，為后續實驗做準備。一般細胞可傳代10-50代。

指數生長期是細胞活力best的時期，可對細胞進行各種實驗。細胞生長一段時間后會呈現接觸抑制。而惡性細胞則無接觸抑制現象。癌細胞則由于營養成分的消耗和細胞代謝產物的影響而發生密度抑制。細胞數量達到飽和密度后，細胞與營養液的交換面積減少，代謝產物積累，pH值下降細胞停止增殖，進入停滯期。在此時應及時進行傳代，否則因細胞中毒受損，大量細胞出現死亡，至少再傳1-2代后，細胞才能恢復。

二、貼壁細胞傳代操作步驟

1）將培養基、胰酶及PBS等預先在37℃水浴中加熱30分鐘；

2）從培養箱中取出細胞，當細胞融合率達到85%以上時即可進行傳代；

3）將培養瓶內的舊培養液吸除或傾倒，使用PBS清洗瓶內殘留培養基，并倒盡；

4）向瓶內加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，確保其能覆蓋培養瓶底部，T25瓶約需1ml，T75瓶約需1-2ml；

5）將培養瓶置于37℃孵箱或室溫（25℃）下進行消化，觀察細胞狀態，待細胞wanquan變圓且輕輕敲打瓶身時有部分細胞脫落為準。一般情況下，細胞消化過程持續1-2分鐘即可完成；

6）直接添加適量含血清的培養基以終止消化，T25瓶可加入2ml或以上，T75瓶可加入3ml或以上；

7）使用吸管吸取瓶內培養液，按順序輕柔地吹打瓶壁，使細胞從瓶壁上脫落；

8）對細胞進行計數，取25μl細胞懸液、65μl PBS與10μl臺盼藍混合均勻后，取10μl置于計數板中，使用顯微鏡進行計數，以判斷細胞濃度；

9）根據細胞濃度進行細胞分瓶培養。一般按照1：2至1：8的比例進行傳代，將細胞接種于新的培養瓶中，置于CO2培養箱中培養。具體傳代比例需依據細胞量而定，傳代過稀會導致細胞生長緩慢，傳代過密則可能引起接觸抑制或密度抑制等問題，影響細胞生長；

10）細胞貼壁后，更換培養液的時間應根據細胞生長狀態和實驗需求而定，一般建議在2至3天后更換培養液。

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