質粒提取常見問題案例梳理，助您實驗！

更新時間：2025-01-15

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出現(xiàn)嚴重的RNA污染

如圖所示，質粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)明顯的RNA條帶，說明有RNA污染。

原因及解決方法：

（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法：補加RNase A。

（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫，導致RNase A活性下降。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。

（3）細菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。

出現(xiàn)基因組污染

（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進行菌體的裂解和中和。

（2）加裂解液 LB時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。

（3）細菌的質量差（反復凍融的細菌，陳舊的細菌，培養(yǎng)條件不合適的細菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細菌。

超螺旋質粒比例低

如圖右所示，質粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，開環(huán)質粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質粒在轉染效率、基因表達水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應超過5分鐘，以免質粒受到破壞

解決方法：優(yōu)化裂解時間；確保質粒的結合和所有溶液都在室溫下進行，減少離心力對質粒超螺旋結構的影響，因為過度的離心可能會破壞質粒的超螺旋結構。

內(nèi)毒素殘留高

常規(guī)質粒DNA純化中，質粒DNA仍需要從55%蛋白質、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離，在質粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結構，其分子量、電荷性和疏水性都與質粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質粒DNA分開。內(nèi)毒素會降低原代細胞和敏感培養(yǎng)細胞的轉染效率，干擾免疫細胞的體外轉染。由于實驗目的不同，對質粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同，尤其是在細胞轉染、基因沉默研究、基因治療等過程中，對質粒質量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻，對于非敏感型的的轉染實驗，要求內(nèi)毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉染實驗，要求內(nèi)毒素殘留＜0.1 EU/ug。

原因：內(nèi)毒素去除時操作不當或者未選擇合適的試劑

解決方法：

（1）如果采用的內(nèi)毒素清除的方法，離心之后，上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質。這時注意不要吸到藍色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質。

（2）在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時，需要先活化樹脂，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂，以確保最佳的去除效率。

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