LNA在基因檢測中的應用

一、LNA的介紹

鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種經過修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2'與4'碳連結在一起。一般可見于A-DNA或RNA。這類核酸可以增加引物或探針（probe）的融解溫度（Tm值），加強這些實驗用物質的穩(wěn)定性，可應用在即時聚合酶連鎖反應（real-time PCR）等技術中。近期,鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在藥學研究領域引起了人們的廣泛關注,有希望成為分子水平治療各種疾病的新突破口.它是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物,結構中含有一個或多個2 ′-O,4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體,核糖的2′-O位和4′-C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋,并連接成環(huán)形,這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內型的N構型,降低了核糖結構的柔韌性,增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩(wěn)定性.由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力.與其他寡核苷酸類似物相比,LNA有很多優(yōu)點:a.和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩(wěn)定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性;c.LNA-DNA雜交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入細胞膜,易被機體吸收;e.體內無毒性作用;f.高效的自動寡聚化作用,合成方法相對簡單,部分或wanquan修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動合成儀上合成。

二、LNA在基因檢測中的應用

1. LNA引物

用鎖核酸修飾引物大大提高了PCR的效率。PCR上游引物的3'末端經LNA修飾后，若3"末端與模板不是互補的，則PCR擴增效率明顯降低，即LNA修飾的引物其識別錯配的能力與DNA引物相比大大提高。普通PCR實驗也證明LNA引物可產生較少的錯配產物，而DNA引物與模板發(fā)生錯配時卻有大量的錯誤產物擴增出。與普通的DNA引物相比，LNA引物所用聚合酶用量少,成本效率高。除此之外,LNA引物還可以減少模板用量。研究發(fā)現(xiàn)，在引物中間修飾一個或三個鎖核酸效果最jia。將鎖核酸修飾在引物的3'端或5 '端或其他的位點,PCR結果顯示，鎖核酸修飾在引物5'端優(yōu)勢更明顯。

2.LNA探針

LNA(Locked Nucleic Acid)探針是一種用于核酸檢測和分析的高效探針，具有增強的特異性和穩(wěn)定性。它們通常被用于實時聚合酶鏈式反應(real-time PCR)、原位雜交、基因表達分析等核酸分子生物學技術中。LNA探針的特殊之處在于它們的核酸結構中包含了Locked Nucleic Acid,即一種經過修飾的核酸單元。LNA中的核苷酸具有特殊的構象，其中的核苷酸環(huán)被修飾以形成一種特殊的結構，使其能夠更強烈地結合目標DNA或RNA。在基因表達分析中，LNA探針可用于檢測特定基因的表達水平。通過與目標基因雜交，LNA探針能夠準確地檢測出基因的表達量，從而幫助研究人員確定基因的表達模式。這有助于揭示基因的功能和疾病的發(fā)生機制。突變檢測是LNA探針應用的另一個重要領域。LNA探針可以與目標DNA序列進行高親和力結合，從而準確地檢測出突變的存在。這有助于對疾病進行早期診斷和治療方案的制定。LNA探針還可以用于基因定位和疾病診斷。通過與染色體雜交，LNA探針可以準確地檢測和定位特定基因或染色體片段。這有助于確定基因的位置和功能，同時也有助于疾病的診斷和治療。

提高 qPCR 探針的熱穩(wěn)定性。摻入LNA核苷酸后，由于LNA在錯配位點形成Watson-Crick堿基對的傾向更強烈，因此qPCR探針通過單核苷酸多態(tài)性（SNP）區(qū)分等位基因的能力會大大增強。熱變性研究表明，當LNA 摻入在寡核苷酸的特定位置時，完mei匹配和錯配之間的 Tm 值存在顯著差異。因此，在 SNP 測定中，與天然狀態(tài)DNA探針相比，LNA qPCR探針雜交具有更強的不穩(wěn)定性，因此能夠更好地區(qū)分出錯配。

由于可以使用LNA調整qPCR探針的Tm值，因此可以獲得具有不同GC 含量的幾個短序列的標準化Tm值。例如，富含AT的天然狀態(tài)DNA qPCR探針通常需要超過30個堿基長（有時需要超過 40個）以滿足擴增子設計指南，但仍有可能表現(xiàn)不佳。使用LNA qPCR探針，通過選擇性定 位LNA核苷酸，有助于產生最佳的、具有高度特異性的短探針。較窄的Tm值范圍對于微陣列和多重PCR應用特別有益，特別是當探針必須在相同條件下與許多不同靶標的同時結合時。