WB實(shí)驗(yàn)中單層貼壁總蛋白的提取方法

一、前言

蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的分子生物學(xué)技術(shù)。Western Blotting實(shí)驗(yàn)單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取步驟：

二、操作步驟

1. 1. 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2. 2. 每瓶細(xì)胞加3ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

3. 3. 按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）

4. 4. 每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。

5. 5. 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）

6. 6. 于4℃下12000 rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）

7. 7. 將離心后的上清分裝到0.5min的離心管中放于-20℃保存。

8. 以上步驟可簡(jiǎn)單概述為：收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞、離心取上清、保存。

三、PBS推薦

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