細胞凋亡的檢測方法

　　細胞凋亡的過程在不同點受到嚴格調(diào)控，因此可以評估所涉及的不同蛋白質(zhì)的活性。由于細胞凋亡和壞死的過程可能重疊，因此必須通過兩種不同的測定來確認細胞死亡的機制。下面讓我們一起來看看細胞凋亡的檢測方法吧！
 

　　1. 細胞形態(tài)學變化
 

　　用光學顯微鏡觀察蘇木精和伊紅染色的組織切片可以觀察到凋亡細胞。該方法檢測的是處于凋亡后期的細胞，但不能識別處于凋亡早期的細胞。透射電子顯微鏡(TEM)是確認細胞凋亡的金標準。
 

　　2. DNA
 

　　DNA laddering 技術(shù)是另一種檢測細胞凋亡的方法，它使細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶切割的產(chǎn)物可視化。這涉及通過瓊脂糖凝膠電泳從裂解的細胞勻漿分離中提取 DNA。所得 DNA 條帶形成 DNA 階梯，可用于檢測凋亡細胞數(shù)量高的組織中的細胞凋亡。然而，DNA 發(fā)生在細胞凋亡的后期階段，因此無法檢測早期階段的細胞。另一種方法是 TUNEL(Terminal dUTP Nick End-Labeling)方法，它也通過酶法標記 DNA 鏈的末端來檢測核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)物。末端轉(zhuǎn)移酶用于將 dUTP 連接到 DNA 片段的 3' 端。然后用各種探針標記 dUTP，以便通過光學顯微鏡、熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)進行檢測。雖然這種技術(shù)很快并且可以在幾個小時內(nèi)完成，但它可能會因壞死細胞而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。
 

　　3. caspases、裂解底物、調(diào)節(jié)劑和抑制劑的檢測
 

　　可以使用各種類型的半胱天冬酶活性測定來檢測超過 13 種已知的參與細胞凋亡的半胱天冬酶。一些免疫測定可以檢測裂解的底物，如 PARP 和已知的細胞修飾，如磷酸化組蛋白。包括蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫組織化學在內(nèi)的多種測定可用于檢測半胱天冬酶活化。Apoptosis PCR microarray是一種較新的方法，它使用real-time PCR來指示大約112個參與細胞凋亡的基因的表達。微陣列旨在生成編碼必需受體、配體、細胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑和參與程序性細胞死亡調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的基因的表達譜。
 

　　4. 線粒體檢測
 

　　證明細胞色素c釋放的線粒體測定 允許檢測內(nèi)在途徑早期階段的變化。激光掃描共聚焦顯微鏡 (LSCM) 創(chuàng)建活細胞的薄光學切片，然后用于監(jiān)測一段時間內(nèi)完整單細胞中的各種線粒體事件。該技術(shù)可測量線粒體通透性、線粒體內(nèi)膜去極化、線粒體氧化還原狀態(tài)、Ca2+通量和活性氧等參數(shù)。
 

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