離心柱法提取DNA的實驗步驟與注意事項有哪些？

離心柱上有硅膠濾膜，在高鹽低pH條件下，核酸能結(jié)合到硅膠膜上，而蛋白質(zhì)和其他代謝產(chǎn)物被洗脫；后續(xù)改變反應(yīng)條件到低鹽高pH來洗脫純化DNA。用離心柱法來提取DNA，得到的DNA質(zhì)量好，純度和濃度較高。那么離心柱法提取DNA的實驗步驟與注意事項有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、實驗步驟

1. 平衡液預(yù)處理

取一個新的吸附柱放在收集管中，懸空加入100μL的平衡液至離心柱中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將離心柱放回收集管中，備用。

2. 處理材料

（1）如提取材料為血液，可直接使用200μL新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，不足200μL可加緩沖液1補(bǔ)足；

（2）貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞和動物組織應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液，然后10000rpm離心1min，棄上清，加200μL緩沖液，振蕩至che底懸浮；

3. 加入蛋白酶K，混勻

（1）提取血液和細(xì)胞基因組時，只需加入蛋白酶K混勻，即可繼續(xù)進(jìn)行下一步；

（2）提取組織基因組時，加入蛋白酶K混勻，需在56℃放置，直至組織溶解，12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。

4. 加入200μL緩沖液2，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

5. 加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，12000rpm離心30s以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入500μL緩沖液3（注意：使用前請確保已加入無水乙醇！），12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入600μL漂洗液（注意：使用前請確保已加入無水乙醇！），離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

9. 重復(fù)操作步驟8。

10. 將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量去除漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以che底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11. 將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位加50~100μL洗脫液，室溫放置3~5min，12000rpm離心2min；將得到的溶液重新放回吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2min，收集DNA溶液。

12. DNA可以存放在2~8℃，若要長時間存放，可以放置在-20℃。

二、注意事項

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，均使用臺式離心機(jī)；

2. 使用前確保緩沖液3和漂洗液中預(yù)先加入無水乙醇；

3. 實驗前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆茫?/p>

4. 第10步，要讓漂洗液揮發(fā)干凈，否則會影響后續(xù)的實驗；

5. 樣品需要避免反復(fù)凍融，否則會影響DNA的得率。

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